Проблеми с HILIC и ACN? Как да стабилизирате HPLC дейностите?

Ацетонитрилът (ACN) вероятно е най-често използваният органичен разтворител за HPLC, поради по-ниската си вискозитетност в сравнение с други органични разтворители като метанол. Въпреки че ACN е идеален за предпазване на колоната и системата ви от повреда поради увеличено обратното налягане от промени във вискозитета на елуента - особено по време на градиентни разделяния - този разтворител също има някои известни проблеми, като замърсяване с частици и полимеризация.
Ако имате затруднения с използването на ACN в HILIC разделянията си, бъдете сигурни, че има няколко начина за отстраняване на проблемите и бързо разрешаване на въпросите.

Ацетонитрилът – перфектният органичен разтворител за HPLC?
Ацетонитрилът, известен още като метилцианид, има основни химични свойства, благоприятни за HPLC.
ACN има по-силна елуентна сила от метанола, смесва се с вода и произвежда ниско обратно налягане в смес с вода.
ACN има минимална UV абсорбция при ниски дължини на вълната (<250 nm) и е съвместим с разтвори, съдържащи ароматни съединения като тирозин и бензоена киселина.
ACN е индустриален страничен продукт от производството на акрилонитрил, което прави съединението широко достъпно и достъпно.

Често срещани проблеми при използване на ACN в HPLC
Въпреки че ACN звучи като перфектен разтворител за HPLC, съществуват и някои недостатъци.
За начало, UV прозрачността зависи от чистотата/качеството на вашия ACN. В зависимост от специфичните изисквания, съществува спектър от различни степени на чистота на ACN за вашия HPLC и LC-MS анализ. За съжаление, тези различни класификации не са хармонизирани между доставчиците, което води до значителни разлики в качеството и намаляване на производителността или дори увеличено износване на вашия инструмент.
Както беше споменато по-рано, ACN е индустриален страничен продукт и изисква пречистване и филтрация за премахване на значителни замърсявания с частици от източника. Поради тази причина качеството на филтрация е ключово за предотвратяване на малки частици, които причиняват течове на възвратните клапани в HPLC помпата или повишено износване на буталата и уплътненията.
Друг често обсъждан феномен е така наречената полимеризация. Публикации показват, че ACN може да полимеризира при екстремни условия или в присъствието на силни киселини, които не се намират във вашата HPLC система.

Как да смекчите проблемите с вашия HPLC анализ, свързани с ACN
Следването на най-добрите практики за HPLC системи е добър старт за предотвратяване на нежелани прекъсвания:

1.    Пазете вашия HPLC инструмент (и компонентите му) чисти
Точно както водата може биологично да се замърси с течение на времето, замърсяванията на ACN могат да се натрупват с остаряването. Поради тази причина планирайте редовни цикли на дезинфекция с подходящ и чист разтвор за измиване, като изопропанол (IPA) или смес с вода, на всеки 4-6 седмици.
Най-добрата практика включва промиване на целия флуиден път от резервоара за разтворител, през помпата до аутосемплера. Настройването на автоматизирана процедура за промиване също може да позволи по-чести цикли на почистване между последователности.
Допълнително, излагането на дневна светлина на бутилките с HPLC разтворител може да ускори растежа на биологично замърсяване. В такива случаи използвайте подходящо покритие за бутилките, като ги обвиете с алуминиево фолио, или преминете към кехлибарени бутилки, ако е приложимо.

2.    Използвайте висококачествени разтворители за предотвратяване на замърсяването на вашата HPLC система
Използването на LC-MS клас разтворители с високо качество на филтрация (<0.2 µm) помага за предотвратяване на въвеждането на частици. Да, висококачествените разтворители са по-скъпи от нормалните, но вземете предвид загубите на производителност и разходите, свързани с прекомерни прекъсвания на вашата LC система.
Имайте предвид, че филтрите на мобилната фаза вътре в резервоарите на вашия HPLC НЕ предпазват от замърсители с подмикронни частици. Тези филтри имат типични размери на порите между 10-20 µm и са предназначени да предпазват вашия HPLC от по-големи отломки, които биха могли сериозно да повредят системата.
Малки подмикронни частици могат да доведат до изтичане на възвратни клапани, блокиране на вътрешни филтри и голямо износване на бутала и високонапорни уплътнения.
Стандартни добавки като мравчена киселина (FA) или трифлуороцетна киселина (TFA) трябва да се третират като разтворителите. Голяма стара бутилка резервоар, отваряна няколко десетки пъти, вероятно не е подходяща за висококачествени разтворители.
Идеално би било да закупите тези добавки в подходящи размери на контейнерите, като ампули.

3.    Помислете за чистотата на стъкларията си
Привикнете да сменяте бутилките с елуент, когато са празни, за да предотвратите натрупването на замърсявания в бутилката. И преди да ги използвате, изплакнете бутилките с чиста мобилна фаза, за да отмиете всякакви остатъци.
Къде оставяте капачката на бутилката с прикрепената линия за разтворител, докато сменяте бутилката? Прехвърляйте директно капачката от празната бутилка в нова.
Трябва също така редовно да инспектирате съдържанието на бутилките с мобилна фаза срещу светлина, като леко разклащате бутилката, за да откриете прах и мръсотия, плаващи в мобилната фаза.

4.    Не оставяйте помпата си в ACN за дълъг период (през нощта)
Не планирате да използвате вашия HPLC в продължение на няколко дни? Няма проблем. Можете да поставите системата си в режим на готовност при по-нисък дебит (50µL/min) или напълно да изключите инструмента.
В последния случай, когато изключвате, промийте помпата с подходящ разтворител като IPA преди да изключите помпата. Ако помпата е потопена в ACN, топчето на възвратния клапан може да се залепи за седалката, предотвратявайки аспирирането на течност. Въпреки че запушените клапани могат да работят отново, това решение изисква деинсталиране на възвратните клапани от модула на помпата.
Ако трябва бързо да рестартирате инструмента си, препоръчва се състояние на готовност при нисък дебит.

5.    Избягвайте смесването на добавки амониев хидроксид с чист ACN
Обща мобилна фаза за HILIC при основни условия на елуиране съдържа амониев хидроксид (NH4OH)/ACN. Тази специфична мобилна фаза може да влоши стандартните високонапорни уплътнения в HPLC помпата ви. Добавянето на малък процент (около 5%) вода в ACN фазата е добър начин за намаляване на влошаването. Тъй като HILIC приложенията обикновено започват със значително количество вода, можете предварително да смесите вода в ACN мобилната фаза.
Ако адаптацията на елуента не е възможна, обмислете смяна на буталните уплътнения. Например, можете да замените стандартните UHMW-PE (полиетилен с ултрависоко молекулно тегло) уплътнения с графитни PTFE (политетрафлуороетилен), които не са засегнати от мобилната фаза NH4OH/ACN.
Обърнете внимание, че PTFE уплътнения са приложими до 700 бара и могат да се използват без компромис, тъй като HILIC приложенията обикновено работят при много по-ниски налягания.
Важно: Поради DLC (покритие от диамантеноподобен въглерод) на буталата на Vanquish Horizon UHPLC системата, не трябва да използвате графитни тефлонови уплътнения!

6.    Отстраняване на проблеми, свързани с ниско налягане в инструмента
Възвратните клапани на помпата в LC системите често са пасивни компоненти, изискващи достатъчно разлики в налягането, за да се осигури затваряне на керамичната топка на пътя на потока без изтичане.
Докато много HILIC приложения произвеждат само около 100 бара (1,500 psi) обратното налягане, съвременните (U)HPLC системи имат много по-високи граници на налягане. В резултат на това тези системи и ключови компоненти като възвратните клапани ще работят под идеалното работно налягане.
Ниското работно налягане може да не е достатъчно високо, за да осигури пълна плътност на възвратния клапан или да не може да извърши почистване на уплътнението, под действието на налягането. Просто решение е да се въведе малък капиляр с вътрешен диаметър между модула на помпата и аутосемплера. Тази промяна ще увеличи обратното налягане за помпата и ще постигне по-добро работно състояние, докато налягането, изпитвано от HILIC колоната, остава непроменено.

За повече информация ТУК