Menu
Вашият надежден партньор за аналитично оборудване и консумативи
MenuФокусирането върху всяка стъпка във вашия анализ ще ви помогне да постигнете по-добро разделяне на пиковете.
Разделяне на пиковете до базовата линия (където вашия детектор се връща към базовата линия между пиковете) е целта за всеки HPLC анализ. Това е така, защото наличието на достатъчна разделителна способност между пиковите двойки гарантира, че можете точно да идентифицирате и бързо да определите количествено всички аналити във вашата проба.
Разделителната способност извън базовата линия - или ко-елуиране на пикове - се причинява от увеличаване изоставането на пика, промени в селективността и лоша чувствителност.
Някои начини за подобряване на разделителната способност са да се възприемат нови химически състави на колоните и да се използват модерни инструменти и софтуерни технологии, но ако нямате възможност да надстроите технологията си, вероятно има няколко неща, които можете да промените в текущия си работен процес, за да подобрите пиковата разделителна способност.
От подготовката на проби до събирането на данни, ето подробен контролен списък с неща, които можете да промените, за да увеличите максимално разделителната способност на пиковете.
Имайте предвид, че трябва да създадете систематичен подход, след като започнете анализа си, като променяте само един параметър наведнъж, като същевременно поддържате останалите последователни, за да определите ефективността на всяка стъпка.
□ Пробоподготовка
Първата стъпка на всеки HPLC анализ започва с подготовка на пробата. Правилното филтриране или извличане въз основа на вашето приложение и системни изисквания, които премахват частици и примеси, ще подобрят разделителната способност.
□ Контейнер за проби
За вашите светлочувствителни аналити, предотвратете разграждането на аналита, като изберете правилните шишенца. Аналитите, които са хидрофобни/хидрофилни, може да изискват да изберете контейнер, който предотвратява нежелано свързване с повърхността на контейнера.
□ Състав на подвижната фаза
Съставът на вашата мобилна фаза е критичен и може да окаже значително влияние върху задържането на аналита и селективността. Неща като съотношение вода/органичен разтворител, pH на подвижната фаза и йонна сила на буфера оказват влияние върху разделителната способност.
□ Избор на колона
Обмислете използването на по-малки размери на частиците и частици с твърдо ядро, което може допълнително да увеличи разделителната способност чрез увеличаване на ефективността. По-дългите колони обикновено означават по-малки частици и по-големи пори. Това подобрява пиковата разделителна способност, но увеличава обратното налягане и времето за анализ.
□ Дебит
В повечето случаи намаляването на скоростта на потока ще намали коефициента на задържане на изхода на колоната, което ще направи всички пикове по-тесни и ще даде по-добър коефициент на реакция. Увеличаването на скоростта на потока може да доведе до разширяване на пиковете, намаляване на разделителната способност – но ще съкрати времето за работа.
Колоните, пълни с по-малки частици и/или частици с твърдо ядро, осигуряват допълнителни предимства при поддържане на висока пикова разделителна способност при по-бързи скорости на потока.
□ Обем на инжектиране
Параметрите на обема на инжектиране, които ще променят вашата разделителна способност, са концентрация на пробата, капацитет на колоната и чувствителност на детектора. В повечето случаи, колкото повече проба инжектирате в колона, толкова повече пикове започват отпред. Времето на задържане може да намалее и да повлияе отрицателно на ефективността и разделителната способност на колоната. Този фактор е известен като масово претоварване.
Претоварването на вашата колона с твърде много проба също ще увеличи максимално границите на детектора и ще причини други неидеални сценарии. Като правило, трябва да инжектирате 1-2% от общия обем на колоната (за концентрации на пробата от 1µg/µl).
□ Температура на колоната
Температурата на вашето отделение за колони играе голяма роля за ефективността и селективността на разделянето.
По-високите температури позволяват по-бърз дебит и по-бърз анализ, но от друга страна могат да причинят влошаване на качеството на пробата и по-ниска разделителна способност. По-ниските температури на колоната ще позволят по-високо задържане, подобрявайки пиковата разделителна способност. Анализът обаче ще бъде по-бавен.
Уверете се, че знаете температурните граници за вашата проба, разтворител, колона и инструментариум и бавно променяйте параметрите в рамките на тези насоки.
□ Обратно налягане в системата
Когато подвижната фаза преминава през колоната/HPLC системата, ще забележите, че се генерира определено налягане. Този термин често се нарича обратно налягане на системата. Отбелязването на обратното налягане в системата е полезен инструмент за оптимизация, особено когато вашата колона и инструмент остареят. Увеличаването или прекомерното обратно налягане са улики, които могат да означават запушване или разрушаване на колоната. Правилната поддръжка, почистване и/или подмяна на колоната може да върне вашата система към оптимално използване. Винаги се обръщайте към препоръчаните от производителя процедури и ръководства за оптимална поддръжка на колоната и техники за почистване.
Детекторът е последната спирка в пътуването на вашата проба. Преди да започнете да оптимизирате настройките на вашия детектор, помислете дали изобщо сте избрали правилния детектор за работата. Променлива дължина на вълната, диодна матрица, зареден аерозол, индекс на пречупване, флуоресценция, единични квадруполни масспектрометри... списъкът може да продължи. Уверете се, че сте избрали детектора, от който се нуждаете, въз основа на свойствата на аналита, чувствителността, обхвата и други.
□ Настройки на детектора
Основните параметри, които трябва да имате предвид, са:
Дължина на вълната: Когато използвате UV-Vis детектори, дължината на вълната трябва да бъде първият параметър за оптимизиране. Чрез оценка на спектъра на абсорбция на аналита, който ви интересува, можете да намерите най-оптималната дължина на вълната, за да получите най-висока абсорбция. Тази техника минимизира смущенията и осигурява по-висока чувствителност.
Време за реакция: Общото правило е, че трябва да настроите времето за реакция на една трета от ширината на пика на половината от височината на най-тесния пик, който ви интересува. (Това изречение може да изисква да го прочетете няколко пъти или да извадите химикал и хартия.)
Събиране на данни: Твърде малко точки от данни могат да повлияят на формата на пика, възпроизводимостта и прецизността на площта. Необходими са минимум 20 - но в идеалния случай 30-40 - точки от данни на пик за оптимална резолюция на пика.
И не забравяйте да се грижите за вашата HPLC система!
Оптимизирането на разделителната способност на вашия инструмент или метод може да бъде отнемащ време процес, но е важна част от всеки анализ и ще ви помогне да се развивате в по-голяма хармония с вашия инструмент.
Още по темата ТУК
